血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA試劑盒檢測結果準確可靠的必要條件。
ELISA試劑盒的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內醫學檢驗一般均用板式點。 本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點，ELISA檢測試劑盒珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應用，嚴格遵照規定操作，必能得出準確的結果。
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清 ）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體 或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清 、尿液），有些則需經預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。
血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，ELISA檢測試劑盒菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA檢測試劑盒中可使本底加深。
一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，ELISA檢測試劑盒超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清
融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體 效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑（見3.2.4）。
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾 水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。ELISA試劑盒每次加標本應更換吸嘴，以發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀的血清，可在試管 中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。
